▎药明康德/报道
很多人说，这次引起疫情的新型冠状病毒非常狡猾。在感染的初期，当患者还没有出现明显症状的时候，它在人体内的病毒载量就可以达到很高的水平，让人防不胜防。为此，找到快速而准确的诊断技术，便成了有效控制疫情扩散的关键。本周，在药明康德举办的“科学战疫线上论坛”上，全球十多位来自不同领域的顶尖专家围绕新型冠状病毒疾病诊断、疗法与疫苗的快速研发、如何应对下一场可能爆发的感染性疾病等话题，在时长3个小时的论坛里分享了他们的宝贵洞见，用科学指引我们前行。在这篇报道中，我们将送上关于“迈向更快、更精准的诊断”这一专题讨论的实录。如您想了解线上论坛的其他专题讨论，请参见药明康德昨日和今日的相关报道。
专题讨论嘉宾：
张锋，霍华德·休斯医学研究所研究员；Broad研究所核心成员Charles Chiu，加州大学旧金山分校（UCSF）传染病学/检验医学和医学教授；UCSF-雅培病毒诊断与发现中心主任施晨阳，艾迪康医学检验中心首席执行官；思嘉基金管理合伙人主持人：Nick Naclerio，Illumina风险投资基金创始合伙人Nick Naclerio博士：我想请Charles Chiu教授首先为大家解读一些最基本也是最关键的信息。COVID-19到底是什么？从何而来？它与我们所熟知的季节性流感，以及SARS有什么不同？Charles Chiu教授：引起COVID-19的是一种冠状病毒。冠状病毒是一个病毒家族，目前约有7种人类冠状病毒被证明会引起感染。其中4种是季节性的，包括OC43和HKU1病毒等，每年都会导致疾病。其余3种则被称为突发性冠状病毒，因为它们会引起疾病的大规模爆发和流行。第一种是2002年出现的SARS冠状病毒，然后是大约十年后出现的引起中东呼吸综合征的MERS冠状病毒。现在出现了第三种人类冠状病毒，也就是这次的新型冠状病毒。它是SARS冠状病毒的近亲，其基因序列与SARS冠状病毒有80%是相似的。它的确切来源尚未确定。我们知道的是，已知早期的病例发生在中国武汉，案例大都与当地一处海鲜市场有接触史。科学家通过观察病毒的序列推测，就像MERS和SARS一样，这次疫情可能是由动物到人类的病毒传播事件引起的，也就是我们所说的人畜共患病传播。我们需要知道的是，这是一种新型冠状病毒，之前它从未出现在人类身上，直到过去的一两个月才在中国武汉地区首次出现。基因组测序等新技术的发展，改变了我们应对类似疾病爆发的方式，在这次新冠疫情的应对中起到了至关重要的作用。2002年非典发生时，研究人员光是确认SARS病毒为一种新型冠状病毒就花了数周的时间。那时研究人员必须培育病毒和使用其他相应技术才能完成这一步骤。而这次的冠状病毒，科学家在一周内就获得了其基因组成信息。一找到病毒，中国科学家就对这种特殊病毒的基因组成进行了测序。这是非常重要的，因为获得了基因组序列，我们就可以开发用于诊断感染以及检测病毒的方法。此外，有了这个序列，我们就可以开发抗体测试来进行监测以及研究潜在的治疗方法和疫苗。而弄清病毒序列是一切的前提，这对我们应对疫情的能力具有重大影响。
Nick Naclerio博士：接下来让我们对话来自艾迪康公司的施晨阳博士，他在中国，可以为我们讲述来自一线的检测经验。施博士，您能给我们介绍检测相关的情况吗？施晨阳博士: 作为中国最大的独立临床实验室之一，艾迪康为武汉提供PCR检测试剂盒。目前，我们在中国有22个实验室，其中约有一半参与了新型冠状病毒的检测工作。特别是在武汉的实验室，从大约四周前就开始了测试，现在每天平均处理几千个样本。这些样本主要来自武汉疾控中心，既有来自发热患者的，也有来自确诊的新冠肺炎患者，还有一些来自疑似患者。随着中国各行业开始复工，我们也开始检测复工人员。在战疫关键期，包括我们在内的五家商业实验室助力武汉当地公立医院完成了大部分的病毒测试工作。目前进行的所有诊断检测，主要是使用市面上可获得的PCR试剂盒。自从去年12月中国疾病预防控制中心对病毒基因组完成测序并对外公布后，许多公司迅速投入到PCR试剂盒的开发中。目前已经有十余个商业试剂盒通过了国家药品监督管理局的批准，还有超过100个类似产品正在注册中。这些还都是在中国原来就已广泛采用的PCR技术的基础上进行的补充和提升。这意味着，中国目前已经有一个非常完善的病毒诊断或检测平台以及相关能力。
Nick Naclerio博士：说到这里，很多人关心PCR检测的假阴性问题，大家担心PCR检测是否足够灵敏，是否会出现漏检？施晨阳博士：这个问题要比大多数人想象得更复杂。首先，正如我刚才提到的，时间非常紧迫。通常情况下，我们要开发一个PCR检测技术，尤其是用于真实世界的临床检测时，需要很多步骤。它需要使用真实世界的证据，进行临床验证。一般来说，这可能会花去几年的时间。然而，特殊时期，很多公司必须在极短时间内拿出检测方法来。就像Charles Chiu教授所说，我们面对的是一个新病毒、新疾病，如何获得检测样本是很大的挑战。大部分试剂盒可能还没有用真正的临床样本来进行临床验证。其次，做检测本身有很多步骤，从制备样本开始，比如怎么采样。鼻拭子、咽拭子样本相对于血液样本更加复杂，因为它们含有很多杂质。而且，对采样人员的技术要求也更高。接着还有样本储存和运输的问题。新冠病毒是RNA病毒，众所周知，RNA非常不稳定，因此存储条件至关重要。所以我们需要一套实验室操作流程来保证RNA的稳定性。这些步骤中任何一个问题都可能导致无法检出病毒感染。现在我们还不能准确地知道假阴性率有多高，这是因为，尽管我们已经做了大量的样本检测，但就像我之前提的那样，不同的实验室采用了不同的检测试剂盒，且相应的患者记录并不是很完备，所以很难去验证这些结果。Charles Chiu教授：除了样本的分析外，还有临床灵敏度的问题。这里的挑战非常大，原因就是我要再次强调的，这是一种新病毒。临床灵敏度数据与病毒载量有关。从患者体内获取的鼻拭子样本里，有多少实际的病毒？这方面的相关信息，直到最近一两周才有一些发表的数据。因此，何时为检测的最佳时间？在患者出现症状之前检测？症状一出现立即检测？还是等到症状严重需要住院再检测？痊愈后还要不要持续检测？对这些关键的问题，我们还没有答案。实际临床过程中，COVID-19的特征和SARS很不一样。感染SARS病毒时，一旦出现咳嗽、发烧等症状，那么鼻拭子、血液中的病毒载量就开始上升；等到病重转入重症监护病房（ICU），病毒载量达到顶峰。但新冠病毒不一样，从目前已发表的一小组患者的数据来看，它的特征有点像流感，即很早就到达高峰。换句话说，被感染者刚出现症状之时，甚至在发作之前，病毒载量是最高的，最容易被检测到。然而，随着病情加重，实际上的病毒载量会下降。所以从根本上来说，COVID-19可能具有不同于SARS的传播特性。这也可以解释为什么我们会看到COVID-19这么容易传播。正因为检测到的病毒实际数量与患者的临床症状严重程度并不具有线性对应关系，使得病毒检测变得极具挑战性。Nick Naclerio博士：您是说，在症状刚刚出现，甚至还没出现的时候，病毒可能更容易被检测出来。而等到患者病重的时候，反而很难获得阳性的检测结果，是这样吗？Charles Chiu教授：是的。事实上，有些住院患者的核酸检测结果会出现波动：今天检测结果可能是阳性的，第二天就变成了阴性，第三天又变成了阳性。这说明，实际上很难用PCR之类的直接检测方法来真正表征病毒感染。尝试间接检测或许是有效的办法。我们在感染性疾病中常用的一种方法是寻找针对该病毒的抗体，以检测抗体来代替检测病毒。举例来说，如果有人感染了麻疹病毒，且没有接种过疫苗，那么身体里就会产生针对麻疹病毒的抗体。同样，假设被新冠病毒感染，我们的身体也会产生针对新冠病毒的抗体。但这在急性爆发时不是很有用，因为人体通常需要一两周才能真正产生抗体。另一种不用直接检测病毒的方法是可以通过查看宿主反应来诊断感染。这就是一些更新的技术（例如RNA测序）可能发挥作用的地方。因为使用RNA测序，实际上可以确定患者对该病毒有什么样的宿主反应。不同的感染类型，比如呼吸道感染，有不同的宿主反应。实际上，也已经有基于宿主反应在开发的临床试验。但新冠病毒的爆发还处于初期，因此尚未开发基于宿主反应的间接检测。我认为，一段时间后，可能需要用间接检测为现有的直接检测测试做补充。Nick Naclerio博士：据我了解，大约有10％的感染患者需要住院治疗，死亡率可能是1％~2％。检测宿主反应有助于确定哪些患者病情最重吗？Charles Chiu教授：我认为是的。以流感或结核病为例，已经证明了宿主反应标志物有判断预后的能力。我们可以看到一些迹象表明，COVID-19在其他国家持续蔓延。如何应对成千上万的病例？我认为，通过诊断测试以帮助我们确定病例的优先级，判断谁可以安全地在家中自我隔离，谁应该转入ICU治疗，是非常重要的信息。Nick Naclerio博士：说到在家隔离，我不禁要问，将来是否有更好的方法让人们待在家里进行网上诊断，而不是和其他患者挤在一起排队等检测。那么张锋博士，我们知道您已经在进行一些基于CRISPR的开创性工作，来提供非常经济的病毒诊断方法。您觉得这会提供一种居家检测的手段吗？
张锋教授: 抗击新型冠状病毒爆发非常重要，也非常紧迫。我们和其他一些研究团队在开发基于CRISPR的诊断方法，总体来说是通过改变CRISPR体系里的特定蛋白质，使它根据病毒或细菌特有的基因特征来识别不同的病原体。我们研究的技术叫SHERLOCK。基本想法是，测试者只要提供血液、尿液或唾液样本，然后把CRISPR蛋白和专门针对病毒特异性序列设计的短链RNA放入样本混合，经过简单的反应，就可以像验孕棒一样，非常容易地在试纸上读出结果：一条线表示阴性（没有感染）、两条线表示阳性（感染）。我们在实验室里初步测试了这种方法的可行性。当然，由于我们还没有来自真实患者的样本，目前只用化学合成的病毒RNA片段进行了验证。根据我们和其他研究组的结果，它能检测到相当低浓度的病毒。这套检测工具已发送到了世界多地的研究人员手中，尤其是中国，还有欧洲。我们希望很快可以看到这套测试工具在真实患者样本上的灵敏度如何，尤其是能不能精确诊断出新冠病毒的存在。基于CRISPR的测试，我觉得最棒的是，只需要花很少的时间就能为新发现的传染性病原体开发和设计新的检测方法。我们从此次COVID-19中获得的方法论，未来可以更快地应用于其他疾病。除了在家就可以用试纸做的检测外，我们和其他团队也在把SHERLOCK技术应用于大规模诊断，比如我参与创立的公司Sherlock Biosciences就在做这个。一旦真的发生大规模流行，需要检测很多样品时，高通量的大规模诊断希望可以起到帮助。而居家个人测试和高通量检测结合起来，都是为了更好地识别并抗击传染病。施晨阳博士：正如张锋教授描述的那样，我认为快速测试是“战疫”的重要机会。现在需要使用PCR试剂盒进行检测，也需要有可靠且快速的测试，用于床旁诊断或家庭检测。尤其是在复工之际，许多雇主和政府机构都希望员工上班之前做好保障。但显然很难让成千上万甚至数百万人一个个做核酸检测。光是采样就有问题，将这么多人排在同一房间，反而创造其他交叉感染的机会，更别说快速测试。因此，我希望看到快速测试以及自助采样的检测技术迅速发展，不仅有利于患者，更有利于对健康人群监测。Nick Naclerio博士：很多观众提问，他们对CRISPR技术的治疗潜力也很感兴趣。您觉得CRISPR有没有可能精确地靶向新冠病毒用于治疗呢？张锋教授：当然，CRISPR本质上是细菌的防御系统，用于对抗病毒。所以，用它来对抗人体内的病毒是个很诱人的想法。大家开发了不同的Cas酶，有的靶向DNA，有的靶向RNA，因此CRISPR系统可以靶向DNA病毒或RNA病毒。新冠病毒是RNA病毒，SHERLOCK诊断法用的Cas13就是针对RNA的，理论上我们可以设计Cas13，让它与新冠病毒RNA结合，破坏病毒的感染能力。就COVID-19而言，我认为了解疾病本身的生物学知识非常重要，比如需要知道病毒感染的组织。而长期挑战，也是CRISPR技术用于治疗的主要挑战，来自递送，也就是我们怎么把酶、向导RNA有效且安全地送到细胞里面去消灭病毒。这也是我们现在主要解决的问题，有很多工作要做。如果我们有了合理的递送方法，就可以尝试治疗病毒感染引起的疾病，比如肝炎，实现这个目标可能还需要几年的时间。但我认为非常重要的一点是，推进这些工作可以服务更长远的前景。目前我们需要应对紧急的新冠病毒爆发，而将来还可能有其他爆发。持续地推进各种技术对于应对下一次疫情至关重要。Nick Naclerio博士：一些听众在论坛的预热提问中指出，这些病毒可能进化和变异，甚至变得更具致病性。Chiu教授是利用二代测序技术研究传染病的专家，您认为二代测序在用于监测病毒方面可以对我们有何帮助？Charles Chiu教授：二代测序就是高通量测序，可以从临床样品或RNA序列中生成数百万个DNA序列。也就是说，我们可以直接从临床样品中组装出病毒的基因组，这一点非常重要，可以跟踪病毒随时间的突变。
举例来说，你可以追踪具体的病毒簇，了解它如何在时空中传播。这对于公共卫生来说太重要了。在寨卡病毒和埃博拉病毒等疫情的爆发中，我们和许多其他人实际上也已经开发出了一种方法，进行基因组监测。实时监控病毒在人群中的传播，也可以为公共卫生干预手段提供信息，让我们知道该采取哪些措施来预防或减少病毒的传播。我相信在诊断感染的同时，我们还应该尽量完成更多的病毒基因组测序。这样就可以让我们更好地知道病毒如何不断发生变化，如何传播，从而让我们更好地预测未来，并希望能预防病毒的进一步传播。Nick Naclerio博士：我们有很多研究人员想知道他们可以提供什么样的帮助。施晨阳博士，也许您可以评论一下，学术研究人员或创业公司如何提供潜在的解决方案。施晨阳博士：我想我们需要更多的人和资源来参与检测方法和技术的验证，以及从诊断的角度更好地理解病毒。就像之前讨论的那样，病毒载量如何随时间发生变化，何时达到峰值？我们能从哪些样本里检测出病毒，以及相应的时间相关性是什么样的？举例来讲，从鼻拭子和咽拭子里获得的样本，与血液或粪便里获得的样本，病毒载量可能是不一样的。因此理解病毒的作用方式，以及它在体内的作用途径，对于开发准确的诊断方法至关重要。
其次，获取样本也是现在的一个挑战，我说的不是样本数量，而是这些样品的临床记录。所以我们需要建立一个样本库，详细记录样本的临床史，以便能够正确验证这些检测方法。当然，我认为像数字PCR、下一代测序等新技术，尤其是便携式的新技术，可以将快速测序部署到医院甚至社区中，这很重要，也很有价值。
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